2020年 05月 12日 星期二
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基因芯片技术的工作原理及技术流程

来源:未知     作者:威廉希尔     发布时间:2020-05-12 08:23         

  候选基因集法的一大关键是基因集的定义。而对此,模式生物的大量基因芯片实验提供了一个良好的基础。基因芯片技术是近二十年生物学领域发展起来的性技术之一,以其高通量、快速、并行检测的特点加快了生命科学研究的步伐。该技术是通过把巨量的已知的寡核苷酸,肽核苷酸或 cDNA 固定在一块面积很小的硅片、玻片或尼龙膜上而构成 DNA/RNA 微阵列,然后将样品基因组 DNA/RNA 进行体外扩增并掺入标记后,与位于微阵列上的已知DNA 序列杂交,用激光共聚焦荧光检测系统或质谱法、化学发光法、光导纤维法等检测方法检测其信号强度。

  它主要是基于近年来的一种全新的 DNA 测序方法——杂交测序法应运而生的。由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上,所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析,解决了传统的核酸印迹杂交操作复杂,操作序列数量少等缺点。基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性、多样化、微型化和自动化,是生物学,微电子学,化学和计算机多学科高度交叉的应用型新型技术,已成为生物科学研究与应用的热点。基因芯片技术在生物学研究领域、医学临床检验领域、生物制药领域和医学领域显示出了强大的生命力。按其分类方法的不同可以分为不同的类型。按支持物的不同可以分为无机片基和有机合成物片基的基因芯片;按探针阵列的形式可分为原位合成和预先合成然后点样的基因芯片;按芯片的功能可分为基因表达芯片和 DNA 测序芯片;按探针的类型不同可分为cDNA 微阵列(或 cDNA 微阵列芯片)和寡核苷酸阵列(或芯片)等。

  基因芯片又称为 DNA 微阵列(DNA microarray),基因芯片的测序原理是杂交测序方法,即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。它是在基因探针的基础上研制出的。所谓基因探针是一段碱基序列,由人工合成,大量的探针固定于支持物的探针上。连接一些如荧光等物质,以便于信号捕捉。根据碱基互补的原理,待测的基因混合物就能识别这些人工合成的基因探针,然后通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超自组装技术,把大量检测单元集成在一个微小的固体基片表面,可同时对大量的核酸和蛋白质等生物实现高效、快速、低成本的检测和分析。基因芯片因为其探针的不同,可以应用于许多检测领域。最常用的芯片应用是DNA/寡核苷酸芯片用于基因表达谱的检测。这个技术中,来自两个不同样本的 RNA 用两种不同的荧光标记(通常是 Cy3 和 Cy5),然后再将这些 RNA 杂交到由成百上千个 DNA/寡核苷酸顺序排列的玻璃载体上,荧光信号的强弱正好反映了水平,然后用特定的荧光波长扫描芯片得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱。最后可以用特定的分析软件将这些差异表达的基因进行聚类分析,表明他们具有共有的生物学功能。

  基因芯片的技术流程主要包括以下四个要点:(1)基因芯片的制备;主要采用三种方法,即光蚀刻合成法,压电印刷法,点样法。指的是先将玻璃片或硅片进行表面处理后,根据不同方法的不同原理将 DNA/RNA 片段按顺序排列在芯片上。(2)样品制备;生物样品成分往往比较复杂,除非常特殊的样品之外,一般在接触芯片前,这些样品往往要经过特殊的处理。为了提高结果的准确性,来自血液或组织中的 DNA/mRNA 样本须先行扩增,然后再被荧光素或同位素标记成为探针,以提高检测的灵敏度。(3)杂交;生物芯片上生物的反应是芯片检测的关键的一步。影响杂交的因素很多,如时间,温度及缓冲液的盐浓度等。杂交条件的选择要根据芯片上核酸片段的长短及其本身的用途来定。通过选择合适的条件使芯片上的生物之间的反应处于最佳状态,减少错配的比率,提高检测的准确性。(4)信号检测;所谓信号检测主要是杂交图谱的检测和读出。芯片经杂交反应后,各反应点形成强弱不同的光信号图像,用芯片扫描仪和相关软件加以分析,即可获得有关的生物信息。目前最为常用的是激光共聚焦荧光检测系统,原理主要是与探针与芯片上的物质发生生物反应而被激发出的荧光经过棱镜刚好能通过共聚集小孔,而只有这束荧光才能被探测器检测到,其它荧光信号则不能。通过计算机处理后就可直接读出杂交图谱。因为这种方法的高灵敏度和精确度而被广泛应用,这种方法的缺点是扫描所需时间较长。另一种检测系统采用 CCD摄像原理,CCD 指的是电荷耦合器件(Charge Coupled Device),它是一种半导体成像器件,所需的扫描时间较短,缺点是灵敏度和精确度较低。此外,近年来还发展了多种检测方法,目前正在研究的替代方法有质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等。

      威廉希尔